产品目录

本产品是一种即用型的全基因组DNA等温扩增试剂盒，其包含dNTP，BSA，random primer，10×WGA Buffer和能提高全基因组扩增的稳定性和扩增效率的添加剂。2×WGA Master Mix以纯化的基因组DNA或者诸如全血，干血卡，毛囊和培养细胞的生物样本作为模板。客户只需加入变性模板，2xWGA Master Mix，DNA polymerase和ddH2O即可建立一个WGA反应体系。

本试剂盒中的DNA polymerase是具有链置换活性和高聚合活性的聚合酶，其保证等温DNA扩增的高效性。当DNA聚合酶结合到变性的模板DNA上时，引发DNA等温扩增。DNA polymerase 3'–5'核酸外切酶活性保证扩增过程中的高保真性。

采用WGA技术客户无需抽提可以直接从生物样本中获得基因组DNA。通过WGA技术获得基因组DNA包含全部的序列信息可以直接用于PCR，Real time PCR和SNP检测等。

• 按照下述方案准备充足的全基因组扩增反应需要的DCST buffer。
  注意：下表给出的DCST buffer的总量满足16个反应。配制好的Buffer DCST保存不应超过3个月。
  

  成分	用量
  1M DTT	5μL
  DCS buffer	55μL
  总体积	60μL

  
  
• 纯化的基因组DNA变性
  
  • 向PCR管中加入2μL PBS。
    
  • 向上述PCR管中加入1μL基因组DNA，基因组DNA浓度大于等于10ng/μL。
    
  • 然后向上述PCR管中加入3.5μL DCST buffer，充分吸打混匀。
    
  • 将上述样品置于冰上冰浴10min。
    
  • 向上述PCR管中加入3.5μL预冷的NTB buffer，充分吸打混匀，然后立即将PCR管置于冰上。
• 冰上解冻全部试剂然后短暂离心。
  
• 按照下述方案准备反应混合物
  

  成分	用量
  2×WGA Master Mix	12.5μL
  Denatured template	2.5μL
  DNA Polymerase	1μL
  Sterilized ddH2O	至25μL

  
  注意：为了防止变性的基因组DNA复性，请在冰上建立反应混合物。
  
• 将含有反应混合物的PCR管置于离心机中短暂离心。
  
• 将上述PCR管置于恒温水浴锅或者PCR仪中30℃反应12～16h。
  
• 65℃加热10min使酶失活。
  
• WGA产物如果进行PCR扩增，将WGA产物稀释20倍之后每个PCR反应体系中加入1μL稀释的产物。

• 按照上述的方案配制足量的DCST buffer。
  
• 血样和细胞的变性
  
  • 向PCR管中加入2μL PBS。
    
  • 向上述PCR管中加入1μL血样或者细胞(≥600 cells/μl)。
    
  • 向上述PCR管中加入3.5μL DCST buffer，充分吸打混匀。
    
  • 将上述PCR管置于冰上冰浴10min。
    
  • 向上述PCR管中加入3.5μL预冷的NTB buffer，充分吸打混匀，然后立即置于冰上。
    
  • 冰上溶解试剂然后短暂离心。
• 按照下述方案配制反应混合物
  

  成分	用量
  2×WGA Master Mix	12.5μL
  Denatured template	2.5μL
  DNA Polymerase	1μL
  Sterilized ddH2O	至25μL

  
  注意：为了防止变性的DNA复性，请在冰上建立反应体系。
  
• 将上述含有反应混合物的PCR管置于离心机中短暂离心。
  
• 将上述PCR管置于恒温水浴锅或者PCR仪中30℃反应4～12h。
  
• 65℃加热10min使DNA Polymerase失活。
  
• WGA产物如果进行PCR扩增，将WGA产物稀释20倍之后每个PCR反应体系中加入1μL稀释的产物。

• 按照上述的方案配制足量的DCST buffer。
  
• 毛囊细胞的变性
  
  • 向PCR管中加入3μL PBS。
    
  • 向上述PCR管中加入1根毛囊。
    
  • 向上述PCR管中加入3.5μL DCST buffer，充分吸打混匀。
    
  • 将上述PCR管置于冰上冰浴10min。
    
  • 向上述PCR管中加入3.5μL预冷的NTB buffer，充分吸打混匀，然后立即置于冰上。
    
  • 冰上解冻试剂然后短暂离心。
• 按照下述方案配制反应混合物：
  

  成分	用量
  2×WGA Master Mix	12.5μL
  Denatured template	2.5μL
  DNA Polymerase	1μL
  Sterilized ddH2O	至25μL

  
  注意：为了防止变性的DNA复性，请在冰上建立反应体系。
  
• 将上述含有反应混合物的PCR管置于离心机中短暂离心。
  
• 将上述PCR管置于恒温水浴锅或者PCR仪中30℃反应12～16h。
  
• 65℃加热10min使DNA Polymerase失活。
  
• WGA产物如果进行PCR扩增，将WGA产物稀释20倍之后每个PCR反应体系中加入1μL稀释的产物。

• 没有产物
  
  • WGA反应之前变性模板复性。
    ① 保证冰上预冷NTB buffer；
    ② 加入预冷NTB buffer之后立即将样品置于冰上。
    
  • 反应温度太高。
    试剂盒中的DNA聚合酶最佳的反应温度为30℃，请将反应严禁置于30℃。过高的温度导致DNA聚合酶活性降低甚至失活，造成WGA扩增失败。
    
  • 忘记加入相应量的DNA Polymerase。
    2×WGA Master Mix中不含DNA Polymerase，建立WGA反应体系时按照方案加入相应量的DNA Polymerase。
• 采用WGA产物为模板时没有PCR扩增产物
  
  • WGA产物浓度太高。
    稀释WGA产物至50倍 。
    
  • 没有WGA产物。
    琼脂糖电泳检测WGA产物。